盐酸吉西他滨为核苷同系物,属细胞周期特异性抗肿瘤药。主要杀伤处于S期(DNA合成)的细胞,同时也阻断细胞增殖由G1向S期过渡的进程。本品在细胞内由核苷激酶代谢成有活性的二磷酸核苷(dFdCDP)和三磷酸核苷(dFdCTP)。其细胞毒活性就来源于这两种核苷抑制DNA合成的联合作用。二磷酸吉西他滨可抑制核糖核苷酸还原酶,而该酶催化DNA合成过程中生成三磷酸脱氧核苷的化学反应。从而导致脱氧核苷酸(包括dCTP)的浓度降低,三磷酸吉西他滨可与dCTP竞争性结合到DNA上,而细胞中dCTP浓度的降低(由其二磷酸盐的作用而产生)可促进三磷酸吉西他滨与DNA的结合,结果一个核苷酸掺入到合成过程中的DNA链上,从而阻止DNA的进一步合成。另外,DNA聚合酶ε并不能够清除吉西他滨核苷酸和修复合成过程中的该DNA链。